前言
本标准代替 GB/T 4789.34-2008《食品卫生微生物学检验?双歧杆菌检验》。
本标准与 GB/T 4789.34-2008 相比，主要变化如下：
——修改了标准的中文名称；
——修改了培养基和试剂；
——删除了果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）测定和双歧杆菌的计数方法。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
1 范围
本标准规定了食品中双歧杆菌（Bifidobacterium ?）的鉴定方法。
本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a） 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；
b）气相色谱仪配 FID 检测器；
c） 冰箱：2 ℃～5 ℃；
d）天平： 感量 0.1 g；
e）无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm；
f） 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器（200 μL～1000 μL）
及配套吸头；
g）无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。
3 培养基和试剂
3.1 双歧杆菌培养基：见附录 A 中的 A.1。
3.2 PYG 液体培养基：见附录 A 中的 A.2。
3.3 甲醇：分析纯。
3.4 三氯甲烷：分析纯。
3.5 硫酸：分析纯（体积比）。
3.6 冰乙酸：分析纯（体积比）。
3.7 乳酸：分析纯。
3.8 乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附
录B，此溶液浓度约为1 mol/L。
3.9 乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01 mol/L。
3.10 乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4? mL，移入100? mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附
录B，此溶液浓度约为1 mol/L。
3.11 乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01 mol/L。
4 检验程序
双歧杆菌鉴定程序见图 1。
5 操作步骤
5.1样品制备
5.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
5.1.2 以无菌操作称取 25 g（mL）样品，置于装有 225 mL 生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成 1:10 的样品匀液
5.2 稀释及涂布培养步骤
5.2.1 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有 9 mL 生理盐水的
无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制
成 1:100 的样品匀液。
5.2.2 另取 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按 5.2.1 操作顺序，做 10 倍递增样品匀液，每递增稀释一
次，即换用 1 次 1 mL 灭菌吸管或吸头。
5.2.3 根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 稀释液，用 L 棒
在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布,每个稀释度作两个平皿。置 36 ℃±1 ℃温箱内培养 48 h±2 h，培养后
选取单个菌落进行纯培养。
5.3 纯培养
挑取 3 个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36 ℃±1 ℃培养 48 h。
5.4 镜检及生化鉴定
5.4.1 涂片镜检
双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或
球形，可形成各种分支或分叉形态。
5.4.2 生化鉴定
过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌
菌种主要生化反应见附录B。
5.5 有机酸代谢产物测定
气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物, 见附录 C。
6 报告
根据镜检及生化鉴定的结果（5.4）、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于 1（5.5），
报告双歧杆菌属的种名。 |
